家兔皮肤结核模型对结核亚单位疫苗EAMM和MH保护效应的评价研究

【摘要】目的：利用家兔皮肤结核液化模型评价结核亚单位疫苗EAMM(ESAT6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4)和MH(Mtb10.4-HspX)的保护效果,为这两种疫苗的应用奠定基础,同时为结核疫苗保护效果的评价提供一种更加方便、直观的方法。方法：将家兔随机分为五组,即EAMM组、MH组、联合疫苗(EAMM+MH)组、BCG组及生理盐水对照组,每组三只。各组分别以一定剂量与时间免疫(皮下注射)健康家兔。EAMM组、MH组、联合疫苗(EAMM+MH)组每隔三周对家兔进行免疫,共免疫三次。BCG组仅在亚单位疫苗免疫第一次时对家兔进行免疫,生理盐水对照组免疫时则注射等量生理盐水。末次免疫六周后,用ELISA检测各组家兔血清中抗原特异性抗体水平,之后对家兔腹背部皮内注射牛分枝杆菌减毒株BCG(5x106CFU),形成家兔皮肤结核感染病灶。动态观察即每日观察家兔皮肤结核感染病灶处结节的出现及其病理发展过程,记录结节发展各时期的形态及结节到达肉芽肿、破溃、液化高峰以及愈合的时间,每日测量结节的大小；液化高峰期时收集各组家兔皮肤结核结节中的液化物质,并对其中的结核菌载量进行计数；结核结节愈合期时,对结核结节及其周围的组织进行病理切片观察(HE染色)。结果：1.结核亚单位疫苗诱导家兔血清中产生高水平的抗原特异性抗体：生理盐水对照组抗原特异性抗体水平为阴性。EAMM组的抗ESAT6,抗Ag85B抗原特异性抗体水平和MH组的抗HspX抗原特异性抗体水平均高于BCG组(P<0.01)。联合疫苗(EAMM+MH)组的抗ESAT6,抗Ag85B,抗HspX抗原特异性抗体水平也明显高于BCG组(P<0.01)。2.结核亚单位疫苗和卡介苗BCG加速了家兔皮肤结核结节的发展进程：BCG组和联合疫苗(EAMM+MH)组家兔皮肤结核结节的液化进程较一致并且相比于其它各组较快,在BCG攻毒后第8天即开始液化,破溃最早,在BCG攻毒后第11天结节发生破溃,到达液化高峰的时间为第13天。液化高峰时BCG组的结节体积达到679.67±62.31mm3,在所有实验组中最大,明显大于对照组结节体积544.78±64.89mm3(P<0.05)。液化时联合疫苗(EAMM+MH)组结节体积在各组中最小,液化高峰时仅达到380.15±53.85mm3,显著小于对照组结节体积544.78±64.89mm3(P<0.05)。BCG组和联合疫苗(EAMM+MH)组结节最先开始愈合,液化高峰期过后,在BCG攻毒后的第29天这两组结节开始愈合。EAMM和MH组家兔皮肤结核结节的液化进程相比于BCG组和联合疫苗组较慢,然而相比于生理盐水对照组则较快,在BCG攻毒后第13天发生破溃,第15天达到液化高峰。生理盐水组在攻毒后第15天发生破溃,第17天达到液化高峰。液化高峰时EAMM组的结节体积为504.35±65.46mm3,MH组的结节体积为544.05±63.60mm3,显著小于BCG组结节体积679.67±62.31mm3(P<0.05),大于联合疫苗(EAMM+MH)组结节体积380.15±53.85mm3(P<0.05)。3.结核亚单位疫苗降低家兔皮肤结核结节液化高峰期时液化物质中的结核菌载量：联合疫苗(EAMM+MH)组液化物质中的结核菌载量为各组中最低,对液化高峰时脓液中结核菌进行培养计数,联合疫苗(EAMM+MH)组结核菌载量是1.38×106CFU/g,明显低于生理盐水对照组液化物质中结核菌载量(5.34x106CFU/g)(P<0.05),BCG组结核菌载量(3.20×106CFU/g)仅低于对照组结核菌载量(5.34×106CFU/g)(P<0.05).EAMM组液化高峰时结核菌载量(2.04×106CFU/g)和MH组液化高峰时结核菌载量(2.13×1O6CFU/g)则介于BCG组和联合疫苗(EAMM+MH)组结核菌载量之间。4.各组家兔皮肤结核结节病理切片检查结果(HE染色)显示病变均是由BCG引起：对各组家兔愈合时期的结核结节及其周围组织进行病理切片染色观察,均可见不同程度的炎细胞浸润,上皮样细胞增生,淋巴细胞渗出,部分视野可见朗汉斯巨细胞,坏死区域及部分未吸收的液化组织。结论：结核亚单位疫苗EAMM和MH在家兔皮肤结核模型上显示出了良好的保护效果：用EAMM和MH免疫家兔后,可提高家兔血清中抗原特异性抗体水平；加快结核结节发生,发展的进程；降低结核结节液化高峰期时脓液中的结核菌载量。对家兔抗结核的保护效果以联合疫苗(EAMM+MH)最为显著。同时,家兔皮肤结核模型病理特点与人类结核接近,并且方便,直观,因此可利用它来评价结核疫苗的保护效果。
【作者】陈慧昱；
【导师】马兴铭；祝秉东；
【作者基本信息】兰州大学，免疫学，2014，硕士
【关键词】结核病；亚单位疫苗；卡介苗；家兔模型；液化；

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